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十八、制造超高速離心機的幾種分離方法

 

十八、制造超高速離心機的幾種分離方法
    


   

  A.差速離心:逐次增加離心力,每次可沉降樣品溶液中的一些組份。
  差速離心是一種最常用的方法。在這種方法中,離心管在開始時裝滿了均一的樣品溶液。通過在一定速度下一定時間的離心后,就可得到兩個部份:沉淀和上清液。
  通常在第一次離心時把大部分不需要的大粒子沉降去掉。這時所需的組份大部分仍留在上清液中。然后將收集到的上清液以更高速度離心,把所需的粒子沉積下來。離心的時間要選擇得當,使大部份不需要的更小的粒子仍留在上清液中。對于得到的沉淀和上清液可以進行進一步的離心,直到達到所需要的分離純度為止。
  高速離心機差速離心的特點是操作簡單,但分離純度不高。

  B.密度梯度離心法:可以同時使樣品中幾個或全部組份分離,具有很好的分辨率。
  1)速率區帶法(rate zonal):
  根據樣品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速度(S)。大致步驟如下:
  在離心管中裝入密度梯度溶液,溶液的密度從離心管頂部至底部逐漸增加(正梯度)。
  將所需分離的樣品小心地加至密度梯度溶液的頂部。樣品在梯度溶液表面形成一負梯度。
  由于不同大小的粒子在離心力作用下,在梯度中移動的速度不一樣,所以經過離心后會形成幾條分開的樣品區帶。
  注意:樣品粒子的密度必須大于梯度液注中任一點的密度。離心過程必須在區帶到達管子底部前停止。
  2)等密度離心法(isopycnic):
  根據粒子的不同密度來分離。離心過程中,粒子會移至與它本身密度相同的地方形成區帶。
  密度樣度的選擇要使梯度的范圍包括所有待分離粒子的密度。樣品可以在密度梯度液粒上面或均勻分布在密度梯度中。經離心后,樣品粒子達到它們的平衡點。
  注意:平衡后粒子的分離完全由其密度決定,與時間無關,此時再改變離心轉速,只能改變區帶的相對位置。

  2.密度梯度分析法
  1)梯度介質性質與選擇:
  A、應具備的性質 :
  梯度物質的選擇原則是滿足分離方法的基本要求,一個理想的密度材料標準它應是:
  所形成的溶液密度應包括所需要的密度范圍。
  具有某些性質,如折射率,據此可測定它的濃度。
  所形成的溶液粘度低。
  不損傷所分離的樣品。
  離心分離后容易除去。
  不妨礙分離積分的分析。
  B、常用介質種類:
  表一、常用梯度材料在20℃密度
  B.梯度介質應用范圍:
  表二、等密度梯度介質的應用
  表三、各種大分子在蔗糖梯度液中的大約密度
  (2)、梯度溶液的準備:
  計算
  稀釋
 。3)、梯度形狀
  梯度形狀分:線型、等速型、階梯型、平坦型、陡峭型指數梯度。
  梯度形狀對于分離是否成功非常重要:
  最常用的是線型梯度,適用于分離蛋白質、酶、激素、核糖體亞基和一些植物病毒;等速型  適用于分離脂蛋白和一些需上浮分離樣品;不連續或階梯型梯度最適用于分離整細胞、亞細胞組分以及純化一些哺乳類動物病毒或昆蟲病毒。等速梯度以及長液柱可增進分離能力,適用于分離核糖體亞基、多核糖體及植物病毒。
  B.梯度柱制備:
  梯度液柱可以用手工或梯度儀制備
  半注法:
  為縮減離心時間,或分離樣品較少可用半注法:下半管鋪置梯度介質,中間加樣品,上面鋪  Buffer或液體石臘油。
 。4)、加樣方法與加樣量:
  將樣品加到梯度液柱上,針尖和離心管成45-60°角度,慢慢地將樣品沿管壁流到液面上去,對于DNA一類易斷的脆弱樣品,應該用孔徑較大的移液管代替針頭,以避免剪切力對樣品的切割作用。樣品濃度是梯度柱最小密度的1/10(W/W)。
 。5)、轉子的選擇與效應:
 。6)、分離區帶的回收及檢測
  離心后所形成的區帶樣品的回收方法基本有四種:
  a.穿刺法
  穿刺離心管底部,使梯度溶液滴出,將一具有合適閥門的蓋帽放在離心管頂,可控制滴出速度。
  b.虹吸法:
  將一毛細管輕輕插入管底,盡量防止梯度抖動,用微量泵逐漸滴取,以一定量滴數或體積部分收取。
  c.加壓法:
  通過一針管將高密度的液體泵入到梯度離心管的底部,部分收集換出的溶液。
  d.切割法:
  采用專用的切割刀切割所需區帶。
  區帶檢測:
  所謂區帶檢測,實際上是對水平轉子或角轉子和垂直轉子離心管中的分離物質所做的監測,通常只是測量在260或280mm時長的吸收值,以決定梯度中的核酸或蛋白的整個分布,這個操作通常稱之為在線(on line)監測。


 

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